栝楼属（Trichosanthes L.）的系统学研究

黄璐琦 乐崇熙 杨滨 诚静容 李念华 际纯 瞿礼嘉 顾红雅

中国中医研究院中药研究所，北京
北京大学蛋白质工程及植物基因工程国家重点实验室，北京

栝楼属（Trichosanthes L.）是葫芦科(Cucurbitaceae) 中一个比较大的属，共有80多种，大多为雌雄异株，其分布地区为东亚及澳大利亚北训，其中我国有一半的种类。本属有多种药用植物，药用价值很高[中华人民共和国药典]收载了本属植物3种，[中药志]收载了13种，具有止孕和抗爱滋病活性的天花粉蛋白(trichosanthn) 就是从本属植物栝楼(T. Kirilowii Maxim.) 的块根中提取的。然而，作为本属的研究基础--分类学的研究，虽有很多学者（乐崇熙，1972，1980； Jeffrey，1980；陈，1985）做了大量的工作，但未达成共识，特别是栝楼这一复合种的研究，被称为“ The most imtractable taxonomic problem in easterm Asia Cucurbitaceae center” (Jeffrey ，1980)。这些问题严重影响了天花粉药材的使用，据我们对29省、市、区的调查，天花粉商品药材多达28种，其中来源同属近缘植物有19种，有些还具很高的毒性，因此，急需理清分类。为此，我们从世界范围栝楼属植物入手，采用经黄的形态分类学为主，辅以细胞学、孢粉学和组织学等方法，期望能初步理清世界范围栝楼属植物中的种类及属下类群分划问题，解决一些误定和疑难种。同时，我们还采用了分子生物学的方法对栝楼植物，进行了初步的分析。

栝楼属（Trichosanthes L）是林奈于1753年依据蛇瓜T. Anguina L.建立，当时对该属植物仅记载了4种，到目前为止，已确认的栝楼植物有80余种。本属植物通过长期演化，在花序、小苞片、果实及种子上常有差异而形成不同的近缘类群，因此，很多分类学家(Kurz，1877；乐崇熙，1974；Jeffrey，1980；陈书坤，1985)曾把本属分为各组或划分成不同的属，其中乐等人提出如下较具代表性属下分类系统。

王瓜亚属 Subgen . 1. Cucumeroides (Gaertn.) C. Y. Cheng et C.H. Yueh

王瓜组 Sect. 1. Cucumeroides

方子组 Sect. 2. Tetragonosperma C. Y. Cheng et C.H. Yueh

栝楼亚属 Subgen .2. Trichosanthes

小苞组 Sect. 3. Trichosanthes

叶苞组Sect. 4 Foliobracteola C.Y. Cheng et .C.H. Yueh

截叶组 Sect. 5. Truncata C. Y.Cheng et C. H. Yueh

大苞组 Sect. 6. Inovlueraria lser . Wight et Arn.

复叶组 Sect. 7 .Pedatae C. Y. Cheng et. C. H. Yueh

在这一系统的基础上，其他学者分歧概括起来主要是Sect. Truncata 是否能成为独立组， Sect. Pedatae 及Subgen, Cucumeroides的分类地位等。

针对上述分歧，我们在对国内进行广泛调查采集的基础上，从美国（A，MO，NY，UC，US）、英国（K）、澳大利亚（CANB）、泰国（BKF）、马来西亚（KLU）及日本（TOFO）等国有各大标本馆借来标本，系统研究整理了分布于世界各地本属植物的种类，确认有84种8变种，我国有37种6变种，是栝楼属植物的主要分布中心。

栝楼亚属 Subgen 1. Trichosanthes

小苞组 Sect. 1. Trichosanthes

叶苞组 Scet. 2. Folilbracteola C. Y. Cheng et C. H. Yueh

叶苞亚组 Subsect. 1 Folilbracteola

叶苞系 Ser. 1 Folilbracteola

全叶系 Ser .2, Ovifolia C. H. Yueh et L. Q. Huang ser. Nov.

柔毛亚组 Subsect .2 Villosae C. H. Yueh et L. Q. Huang sect. Nov.

大苞组 Sect . 3 Involucraria (Ser.) Winght et Am

大苞亚组 Subsect . 3 .Bracteatae C. Jeffrey ex S. K. Chen

复叶亚组 Subsect . 4 Pedatae (C.Y .Cheng et C. H. Yueh) C. Jeffrey

王瓜亚组 Subsgen .2. Cucumeroides (Gaertn.) C. Y. Cheng et C. H. Yueh

王瓜组 Sect. 4. Cucumeroides

方子组 Sect. 5. Tetragonosperma C. Y. Cheng et. C. H. Yueh

栝楼属植物的细胞学研究报道较少，Darlington （1955）指出本属植物染色体基数为X=11。我们对16种本属植物进行了细胞学研究（表1），方法是取用种子萌发的根尖为材料，经对二氯苯饱和水溶液处理，卡宝品红（carmine）染色和压片；每种植物观察细胞大约100个分裂相，按李等（1985）的方法进行核型分析，该型对称性按 Stebbins（1971）的确定的分类标准划分，核型不对称性系数按 Arano （1963）标准确定，染色体相对长度系数和相对长度公式按Kuo et al.（1972）方法。

1. 本属染色体的变化主要是数目产变化，即形成基数为11的整倍性的多倍体系列为演化趋

势，而核型结构变异小，没有明显演化趋势。

2. 多倍体与器官特化及地理公布规律性的相关不明显。
3. 本实验所得到的染色体核型类型为A、B型，按Stebbins 的分类原则，都属于较对称类

型。同时，对在分类上有争议的4个种进行了分类的探讨，例如湖北栝楼(T. Hupehensis C.Y.Cheng et Yueh) 与花叶栝楼(T. Schizostrona Hayata)，在外部形态上没有稳定的区别，在染色体上核型都为 2n=2X=18m(2SAT)+4sm，因此，二者应予合并（黄等，1994）。

表1 栝楼属植物染色体情况一览表

最早对栝楼属花粉形态的研究始于Erdtman （1952），他对复叶栝楼T. Pedata Merr. Et. Chun 的花粉进行了研究，随后别的学者分别对蛇瓜(T. Anguina L. )、 王瓜( T. Cucumeroides (Ser.) Maxim.) 、大苞栝楼( T. Bracteata (Lam.) Voigt)的花粉都有过简单描述。比较全面系统地进行研究的是乐崇熙等人（1986）的研究，包括我国栝楼30种及公布于日本的多裂栝楼 T. Multiloba Miq 。我们则观察了产于国外的本属31种及1变种的花粉在学学显微镜子及扫描式电子显微镜下的形态特征。

花粉材料均取自叶标本（黄等1997表1），光学显微镜的样品制备采用Erdtman（1952）的醋酸酐分解法，扫描电镜样品的制备直接撒在粘于铜托上的双面胶带上，经真空镀膜直接观察。花粉描述采用Erdtman（1969）的述语。

1．复叶亚组在花粉上的特片为花粉体积较大，具粗网状纹饰，这与大苞组相近，从而支持将其并入大苞组做为一亚组。

2．柔毛亚组花粉为细网状或光滑，与大苞组不同，而近于叶苞组，同时因没有叶苞亚组所具有的明显的沟，支持在叶苞组中成一自然类群。

4. 从花粉特征上支持一些植物的成立，如石垣栝楼T. Ishigakiensis Walk 与中花栝T.Roshornii Harms的关系,二者不仅在外部形态上区别很大，如T. ishigakiensis 为木质藤本，雄花为2-6条总状花序并生，T. Rosthornii 为草质藤本，雄花或单生，或为一总状花序或两者并生；而且在花粉上两者也有区别，前者为粗网状，后者为细网状，因此，把二者合并是不妥的（黄等，1997）。

种子表皮的形态学研究在栝楼属植物的分类学研究中占有重要地位，为此，我们对本属31个种和3变种植物的种皮的组织构造进行了扫描电子显微镜的观察和比较（表2），所观察材料为成熟种子，用双面胶带固定于电子显微镜样品台上，经真空镀膜，在扫描电镜下直接观察其种脐、中部（王瓜亚属为侧臂中部）及合点三个部位。

实验结果表明本属种皮特征为四种类型：长方网型（A型）、波浪型（B型）、蜂窝型（C型）、不规则型（D型），从种皮特片上很好地支持了对本属属下划进行修改的合理性，如方子组种子表面特征为A型，有别于王瓜组中的C型为主，因此，支持王瓜组与方子组应是二个同的自然类群。大苞组与叶苞组都以A型为主，兼顾其他三种类型，与别的组有明显不同，显示出在种皮表面特片上的相近性，但大苞组的A型条纹细，叶苞组的A型条纹粗，因此，种皮表面特征很好地表现出二组之间相近而又不同的关系。

表2 栝楼属植物种皮特征一览表

分子生物这实验方法已被越来越多地应用于植物系统发育研究中，用得较多的是核糖体DNA（rDNA）和叶绿体DNA，rDNA转录了核糖体RNA（rRNA），在染色体以上中等重复、连续的形式排列，每一个重复单位都有负责转录及转译18S rRNA、5.8 rRNA和28S rRNA的片段，其中18S及28S十分保守，在这三段DNA之间，有两个非编码转录片段（Internal Transcribed Spacers, ITS），它们是中度保守区域，还有一个介于28S rRNA和下一个复复单位之间的非转录区IGS，这是一段最不保守的区域。我们试图从rRNA的序列分析中寻找可用来进行遗传变分析或类群鉴定的分子标记。

1. rDNA的RFLP分析

RFLP（限制性片段长度多型性）分析是研究DNA多型性有效手段，对Rdna的RFLP分

析已被成功用于多种生物的种间亲缘关系等方面的研究，但对于栝楼属植物的相关研究未见报道。因此，我们对栝楼居群内雌雄株共九个个体rDNA进行了RFLP分析。

总DNA提居方法按略加修改的CGBA法（Doyle and Doyle,1987；丁等，1995）进行。所用探针是大豆的rDNA复复单位克隆。所用内切酶为 BamHI、 EcoRV、 HindIII、 HinfI、 KpnI 、XbaI、 SmaI 、XhoI (Pronega公司)。

结果及讨论：限制性内切酶水结解后的rDNA片段长度分析表明，栝楼雌雄株rDNA的栲贝长度为14.0kb，比葫芦科中近缘的南瓜属(Cucurbita )的10kb 和11.5kb要大(King，1993)，是目前葫芦科报道中最长的rDNA拷贝。

RFLP所能检测的DNA多态性主要是酶切位点的碱基突变，片段插入或后缺失、片段倒位或易位等，因此其分辨能务与DNA中这些变异的多少有关。在本研究所检测的雌雄株九个个体中，雄株不同个体之间表现了较为丰富的多态性，而雌标较为均一：HindIII 、XbaI、HinfI、 XhoI、BamHI等酶在雌雄株rDNA上的酶切位点一致，而EcoRI、 SmaI、 EcoRV是在雌雄株rDNA上有著不同位点，但在雌雄株的不同个体之间却相一致，表明雌雄株在共同进化过程所表现出的超异性。

在本研究中EcoRI、EcoRV、SmaI等是能较好地反映出栝楼rDNA多态性的限制性内切酶；BamHI、HinfI二种则能对栝楼rDNA酶解产生较多片段，这5种酶配合使用，就能基本上把栝楼rDNA的主要RFLP模式显示出来。便从目前的研究结果看，rDNA的RFLP变化式样在栝楼居群变化较大，较难用于此复合种的遗传多样性分析。

二、rDNA的ITS序列分析

rDNA的ITS及ITS2在被子植物中长度很保守，均约200-300bp，易于进行PCR扩增及测序分析，同时它属于中度保守的序列，这些特点使短小的ITS区可提供足够多的信息作种或种以下系统分类研究及遗传变异分析，对本属的研究国内外救还未见报道。在此我们报道栝楼属植物rDNA ITS的序列。

植物材料与方法：栝楼叶子采自北京医科大学校园。DNA提取方法 同上，RCR扩增方法参照瞿礼嘉等（1995）。DNA测序在ABI 373A DNA自动测序仪上进行。

结果与讨论：测得ITS1及ITS2的序列如下：

ITS1序列198 bp

ITS2序列215 bp

栝楼的ITS区域与葫芦科中出已知的ITS区域相似性很高。在具体操作过程中，我们遇到了真菌的干扰，很多样品都有真菌的污染，使得这项测序工作很费时、费力，而且不能直接用PCR产物测序。因为我们的目的之一是想寻找一种能快速鉴定花粉正品的分子标记，所以我们现在正在试用无菌苗的随机扩增DNA多态性（RAPD）的方法及叶绿体DNA的片段分析方法。

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